Genetic Analyses of Tumor Progression in Colorectal Cancer

1 ABSTRACT Colorectal tumors are responsible for more than 600 000 deaths per year worldwide and thereby constitute the second most common cause of cancer related mortality. Early detection is related to improved prognosis and identification of genetic biomarkers would meliorate available diagnostic tools. Existing tumor classification systems lack precise monitoring within individual tumor stages in relation to progression. Therefore, we performed genetic characterization of tumor progression by analyses of colorectal tumors and normal colon mucosa. We used combined microarray analysis to obtain a set of candidate biomarkers, starting with genome-wide array-based DNA analyses to screen for tumor-specific aberrant DNA patterns followed by correlations to the associated changes in mRNA and microRNA expression. We also investigated the relation between functional p53 and tumor progression as well as survival in patients with colorectal cancer (CRC). Furthermore, we used high resolution oligonucleotide array based CGH to identify nonpolymorphic structural variation in DNA from normal colon biopsies from patients with confirmed CRC to reveal candidate regions with association to putative familial CRC genetic variants. Colorectal tumor progression is proposed to follow a step-wise transformation from normal cells into malignant tumors, and therefore we used different stages within this model to summarize our results, in terms of genetic events of potential importance. First, gain in parts of chromosome 20 encompassing AURKA, as well as alterations in p53 (17p13.1), may be involved in the development from adenoma to carcinoma. Second, loss of 18q and gain of 8q harboring SMAD7 and PTP4A3 appear to rise during progression defined as early (Dukes A and B) to late (Dukes C and D) tumor stage. Third, distant metastatic potential may be associated to loss of 8p and increased expression of miR-373. Fourth, putative structural variants observed in normal colon mucosa may predispose for the onset of malignant transformation in familial sporadic CRC. Finally, there is a clear relationship between increased properties of aberrant DNA content as well as the number of combined genetic events and tumor progression. We conclude that correlated changes in DNA and RNA abundance may represent a robust rationale for selection of genetic biomarkers. Moreover, our results also suggest that Dukes D tumors possibly develop in a way that does not fit into the stepwise progression model, illustrated by earlier onset and less genetic aberrations. These results represent a set of genetic events that can hopefully contribute to improved procedures considering diagnosis and prognosis in CRC patients by providing genetic biomarkers. POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING Varje år avlider mer än 600 000 människor i världen av cancer i tjockoch ändtarm, som är den tredje vanligaste cancerformen och näst vanligaste cancerrelaterade dödsorsaken i Sverige och världen. De patienter som diagnostiseras med tjockeller ändtarmscancer på ett tidigt stadium har större möjligheter till en tidigare insatt behandling och därmed oftast en bättre prognos. Därför är det viktigt att kunna identifiera tidiga tecken på cancersjukdom samt att förstå den genetiska orsaken till varför vissa tumörer sprider sig (metastaserar). Cancer är en genetisk sjukdom, som uppkommer genom förändringar i cellernas arvsmassa. Arvsmassan består av kromosomer som innehåller DNA. I DNA-sekvensen finns gener som fungerar som ritmall för de proteiner som cellerna behöver tillverka för sin funktion. Som budbärare mellan DNA och proteiner använder kroppen ytterligare en molekyl som kallas RNA. I denna avhandling har både kromosomer, DNA och RNA studerats i tumörceller från tjockoch ändtarmscancer och jämförts med arvsmassa från normala celler. Kromosomala avvikelser innebär att den normala sammansättningen av DNA är rubbad, vilket kan ge upphov till förändringar i de proteiner som generna kodar för. Fundamentalt för avhandlingen var att förstå tumörernas genetiska ursprung och utveckling (progression). Vi har använt avancerade DNA-tekniker som möjliggör analys av hela det mänskliga genomet på samma gång. Tusentals fragment av arvsmassa (DNA), gener (DNA eller RNA) och kontrollelement för hur generna styrs (mikroRNA), mäts genom att man kopplar olika färger till DNA, RNA och mikroRNA och jämför skillnaderna i färgintensitet mellan tumörceller och normalceller. Denna teknik kallas microarray och har utvecklats under det senaste årtiondet. De tumörspecifika kromosom förändringar som identifierades, kopplades sedan till olika stadier av sjukdomen, från den enklaste formen då patienten har god prognos till avancerad metastaserande cancer med dålig prognos. Vi studerade även överlevnad, genom att jämföra patienter som friskförklarats och överlevt mer än tio år efter operation med patienter som avlidit inom ett år efter operation, till följd av tumörsjukdom. Resultatet visade att mycket tydliga förändringar i stora delar av kromosom åtta var kopplade till metastaserande tumörer och tumörer från patienter med kort överlevnad. Stora avvikelser identifierades också i andra kromosomer med koppling till andra tumörstadier. I nästa steg jämförde vi därför om det fanns en koppling mellan generna och deras proteinprodukter. För att få en uppfattning om hur mycket proteinproduktionen ökar eller minskar som en följd av genförändringen, mäter man RNA. Våra resultat visade att kromosom 20 i samtliga tumörstadier innehöll gener som var förändrade på både DNAoch RNAnivå och därigenom troligen är kopplade till tumöruppkomst. En av generna, AURKA, har tidigare kopplats till ett förstadium till tumörer i tjockoch ändtarm. p53 är en annan gen som är viktig för tumörutveckling, men som enligt vår studie saknade betydelse för prognos. Totalt identifierades 36 gener och två mikroRNA som kopplades till metastaserande tumörer POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING och som återfanns på kromosom 7, 8, 13 och 18. Dessa gener bör vidare studeras genom utökade analyser, för att konfirmera om de kan kandidera som prognosmarkörer. Dagens forskare ägnar stort fokus åt att identifiera skillnader i den normala mänskliga arvsmassans sammansättning. På så vis hoppas man kunna koppla dessa skillnader, som är betydligt fler än förväntat, till olika sjukdomstillstånd, tex. cancer. I det fjärde delarbetet undersökte vi DNA från normal tarmslemhinna och blod från patienter med cancer i tjockoch ändtarm och fann ett antal DNA förändringar som potentiellt kan komma att kopplas till en ökad risk att utveckla sjukdom (familjära riskfaktorer). Dessa förändringar behöver dock verifieras i DNA från ett större antal patienter. Sammantaget har våra analyser resulterat i en mängd fynd i arvsmassa med kopplade genetiska förändringar som förhoppningsvis kan leda till en förbättrad diagnostik och/eller prognosbedömning av patienter med tumörer i tjockoch ändtarm.